Hidrogeles fibrosos bajo confinamiento biaxial

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 3264 (2022) Citar este artículo

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El confinamiento de hidrogeles fibrosos en capilares estrechos es de gran importancia en los sistemas biológicos y biomédicos. El estiramiento y la compresión uniaxial de hidrogeles fibrosos se han estudiado ampliamente; sin embargo, su respuesta al confinamiento biaxial en capilares sigue sin explorarse. Aquí, mostramos experimental y teóricamente que debido a la asimetría en las propiedades mecánicas de los filamentos constituyentes que son suaves a la compresión y rígidos a la extensión, los geles filamentosos responden al confinamiento de una manera cualitativamente diferente a los geles de filamentos flexibles. Bajo un confinamiento fuerte, los geles fibrosos exhiben un alargamiento débil y una disminución asintótica a cero de su relación de Poisson biaxial, lo que resulta en una fuerte densificación del gel y un flujo débil de líquido a través del gel. Estos resultados arrojan luz sobre la resistencia de los coágulos oclusivos tensos a la lisis con agentes terapéuticos y estimulan el desarrollo de tapones endovasculares efectivos a partir de geles con estructuras fibrosas para detener el sangrado vascular o suprimir el suministro de sangre a los tumores.

Las redes fibrosas son un componente estructural y funcional importante de los tejidos y las células vivas. La actina es el elemento principal del citoesqueleto1; la fibrina es un elemento crucial en la cicatrización de heridas y la trombosis2, y el colágeno, la elastina y la fibronectina son los constituyentes de la matriz extracelular en el reino animal3. Las redes reconstituidas de biopolímeros fibrosos han surgido como materiales con una amplia gama de aplicaciones en la ingeniería de tejidos4.

Las redes de filamentos representan una clase distinta de materia blanda biológica, con propiedades mecánicas distintas de las de las redes de moléculas flexibles5. Algunas de estas propiedades se han desarrollado durante el curso de la evolución para controlar la respuesta de la materia biológica a la deformación6. Por ejemplo, las redes fibrosas muestran una elasticidad lineal con pequeñas deformaciones7,8, mientras que con una deformación mayor muestran un aumento de la rigidez9,10, lo que garantiza la integridad del tejido. Las implicaciones de otras propiedades mecánicas de los geles fibrosos, por ejemplo, la tensión normal negativa en respuesta a la tensión de cizallamiento11,12 aún no se han descubierto.

Las propiedades mecánicas de los hidrogeles fibrosos semiflexibles se han estudiado bajo estiramiento uniaxial13,14 y compresión8,15, sin embargo, no se ha examinado su compresión biaxial inducida por confinamiento en tubos o capilares estrechos. Aquí, informamos los hallazgos experimentales y proponemos teóricamente el mecanismo del comportamiento del hidrogel fibroso bajo confinamiento biaxial en un canal de microfluidos.

Se generaron microgeles de fibrina con una relación de concentración de fibrinógeno a trombina variable y diámetro, D0, de 150 a 220 μm utilizando un enfoque microfluídico (Fig. 1 complementaria). La Figura 1a muestra una imagen de microscopía de fluorescencia confocal (CFM) de microgeles marcados con tinte fluorescente. Los microgeles tenían forma esférica, polidispersidad por debajo del 5% y una estructura uniforme en la escala examinada por CFM (Información complementaria y videos S1 y S2). El tamaño medio de los poros de los microgeles (determinado midiendo la permeabilidad de Darcy16) se redujo de 2280 a 60 nm con un aumento del contenido de fibrina de 5,25 a 37,9 mg/ml y una reducción de la concentración de trombina de 2,56 a 0,27 unidades/ml, respectivamente (Figs. 2 complementarias). , 3 y Tabla Suplementaria 1). La rigidez del microgel correspondiente aumentó de 0,85 a 3,6 kPa (Fig. 4 complementaria). Se utilizaron microgeles de agarosa con diversas rigideces como ejemplo de geles formados por hebras flexibles17.

una imagen de microscopía de fluorescencia de RM marcados con isotiocianato de fluoresceína (FITC) suspendidos en TBS. La barra de escala es de 500 μm. b Imágenes SEM del SM (arriba) y RM (abajo). Las barras de escala son de 500 nm. c Esquema del canal de microfluidos que contiene un canal en general (diámetro de dl) y una constricción con el ángulo de entrada, α, de la región cónica de 15° y un diámetro, dc = 65 μm. d De izquierda a derecha: imágenes de microscopía óptica de RM (diámetro de D0) en el canal en general, la zona cónica y en la constricción (longitud del gel confinado de Dz). Las barras de escala son de 100 μm. e, f Imágenes TEM del RM no deformado (e) y el RM oclusivo (f), después de su confinamiento de una hora en la constricción a 1/λr = 2,7, liberación posterior y fijación con solución de glutaraldehído al 5% en peso en TBS. El diámetro del RM no deformado fue de 176 μm. La barra de escala es de 100 nm.

Nos centramos en los microgeles de fibrina con una rigidez de 0,85, 1,87 y 3,6 kPa (más adelante en el texto denominados microgeles blandos (SM), microgeles de rigidez media (MM) y microgeles rígidos (RM), respectivamente). Esta gama de fibrina la rigidez de los geles fue del mismo orden de magnitud que la reportada para los coágulos sanguíneos18,19 y, por lo tanto, los geles de fibrina estudiados en nuestro trabajo tienen relevancia directa para los sistemas biológicos reales.La Figura 1b, arriba y abajo, muestra una imagen de microscopía electrónica de barrido (SEM). de la estructura de SM y RM, respectivamente. Una red SM estaba formada por fibras más gruesas con menos puntos de ramificación, en comparación con la estructura RM, de acuerdo con informes anteriores20,21 (Fig. 5 complementaria). La diferencia en la estructura del hidrogel se correlacionó con la tendencia en la variación de sus propiedades: la permeabilidad del gel se redujo con la disminución del tamaño de los poros de SM a MM a RM (Tabla complementaria 1), mientras que la rigidez del gel cambió en el orden opuesto. La estructura del microgel no cambió notablemente después de 30 días de almacenamiento a 4 ° C (Fig. 6 complementaria).

La figura 1c muestra un esquema del canal de microfluidos con una sección transversal circular, que contiene (de izquierda a derecha): un canal en general con diámetro dl, en el que el microgel permaneció sin deformar, una región cónica, una constricción con diámetro dc < D0, una región cónica y un canal en general con diámetro dl (Fig. 7 complementaria). En un experimento típico, se introdujo un microgel bajo una diferencia de presión positiva ΔP de 0,2 a 16 kPa en el canal de microfluidos (Fig. 8 complementaria). Este rango de presiones corresponde a la presión arterial biológicamente relevante (120 mmHg = 16 kPa)22. La Figura 1d (de izquierda a derecha) muestra imágenes representativas de un RM en el canal en general, la región cónica y la constricción. El movimiento y la forma del microgel se registraron y analizaron utilizando un programa MATLAB. Es importante destacar que, en la región cónica y la constricción, el microgel estaba en contacto conforme con las paredes del microcanal (Fig. 8 complementaria). El grado de confinamiento radial del microgel D0/dc = 1/λr en la constricción estuvo en el rango de 2,4 ≤ 1/λr ≤ 4,2, donde 1/λr es la relación de compresión. En ΔP > ΔPtr, el microgel pasó la constricción, donde ΔPtr es la diferencia de presión de translocación. La longitud y el tamaño de los poros de los microgeles confinados biaxialmente se determinaron para su estado equilibrado, ya que tener en cuenta la viscoelasticidad del gel es de suma importancia en los sistemas biológicos. El tiempo de equilibrio fue de 10 y 30 min para los microgeles de agarosa y fibrina, respectivamente. Después de estos intervalos de tiempo, el microgel confinado alcanzó su posición y forma de estado estable, que se registraron con una cámara de alta velocidad y se analizaron con MATLAB.

Las Figuras 1e, f muestran imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de la estructura del RM no deformado y confinado biaxialmente. Tras el confinamiento de RM en la constricción, el tamaño de los poros del microgel se redujo significativamente y su forma se volvió anisotrópica, con dimensiones más pequeñas en la dirección de la compresión, de acuerdo con un informe anterior23.

La compresión biaxial en la constricción resultó en el alargamiento del microgel en la dirección no restringida por el factor λz = \({D}_{{{{{{\rm{z}}}}}}}\)/\({D}_ {0}\), donde \({D}_{{{{{{\rm{z}}}}}}}\) es la longitud del microgel confinado. La figura 2a muestra la variación de λz frente a 1/λr para microgeles de fibrina y agarosa. Sorprendentemente, para una fuerte compresión de 2,4 ≤ 1/λr ≤ 4,2, los microgeles de fibrina exhibieron un alargamiento insignificante λz de 1,12 +/−0,03, que solo se vio afectado débilmente por el valor de 1/λr. Tal respuesta al confinamiento biaxial contrastaba marcadamente con el comportamiento de los microgeles de agarosa confinados, para los cuales se observó una mayor elongación λz = 1,3 incluso con una compresión más débil de 1/λr = 2,6.

a Variación en el alargamiento λz medido experimentalmente de microgeles de agarosa con varios módulos elásticos (2,6 kPa, diamantes huecos verdes; 8,3 kPa, círculos huecos marrones; 12,5 kPa, cuadrados huecos naranjas; y 20,2 kPa, triángulos huecos invertidos magenta) y SM (sólido rojo círculos), MM (cuadrados negros sólidos) y RM (triángulos azules sólidos). Las líneas continuas muestran λz predicho teóricamente de agarosa (línea verde) y microgeles de fibrina (los colores de las líneas y los símbolos coinciden). b, c Arriba: esquema de cadenas de red de agarosa (b) y fibrina (c) antes (izquierda) y después (derecha) de la compresión biaxial. Abajo: las formas de las redes correspondientes antes y después de la deformación. Las direcciones de compresión x e y se muestran mediante flechas magenta y marrón, respectivamente. En las caricaturas superiores, los hilos de la red orientados a lo largo de estas direcciones x e y se muestran como las líneas de color magenta y marrón correspondientes, mientras que los hilos orientados en la dirección z sin restricciones se representan con líneas verdes. En el gel de fibrina (c), las hebras magenta y marrón orientadas en las direcciones x e y están más dobladas que en el estado no deformado, mientras que las hebras verdes orientadas en la dirección z están dobladas y estiradas. La tensión entre las direcciones de compresión y estiramiento se transmite a través de los filamentos con orientaciones intermedias. En los geles de agarosa, las hebras de todas las orientaciones determinan la presión osmótica, lo que contribuye significativamente a la deformación del gel. d Variación prevista en la relación de Poisson biaxial, \({\nu }_{{{{{\rm{b}}}}}}}^{{{{{{\rm{eff}}}}}}} =-{{{{{\rm{ln}}}}}}{\lambda }_{z}/{{{{{\rm{ln}}}}}}{\lambda }_{r}\ ), para la compresión equibiaxial de geles de agarosa (línea verde) y fibrina (línea roja). El recuadro ilustra la deformación biaxial de los geles. e Variación en la presión de translocación, ΔPtr, normalizada por la rigidez del gel S, representada en función de la relación de compresión para microgeles de agarosa y fibrina. Los colores de los símbolos corresponden a los de (a). Las líneas verde y roja representan las relaciones teóricas entre ΔPtr/S y 1/λr para geles de agarosa y fibrina, respectivamente. El fragmento punteado de la línea roja muestra el aumento de ΔPtr a una fuerte compresión, debido a las interacciones entre fibras.

Esta diferencia se debe al diferente mecanismo de deformación de las redes de microgeles de fibrina y agarosa que se componen de filamentos flexibles24 y rígidos25, respectivamente. La compresión biaxial de un gel flexible conduce a la disminución de su volumen y al aumento relacionado de la concentración y la presión osmótica que da como resultado el alargamiento del gel en la dirección libre. El alargamiento final del gel está determinado por el equilibrio del aumento de la energía libre entrópica de las cadenas extendidas y la disminución de la energía libre osmótica debido a la menor concentración de polímero en el gel extendido17. Para una fuerte compresión biaxial, el alargamiento del gel aumenta a medida que λz ≈ 0.6 \({{\lambda}_{{{\rm{r}}}}^{-2/3}}\) (ver la línea verde en la Fig. 2a y Discusión Complementaria Sección 5.3.3). Los cambios en la conformación de las hebras flexibles antes y después del confinamiento biaxial y de las formas de red correspondientes se ilustran en la Fig. 2b.

En marcado contraste, los geles filamentosos como la fibrina responden al confinamiento biaxial de una manera cualitativamente diferente. Los filamentos que están predominantemente orientados paralelos a la dirección de compresión, se doblan (disminuyendo así la distancia entre los puntos de entrecruzamiento), mientras que los filamentos que son en su mayoría perpendiculares a la dirección de compresión se enderezan y estiran por fuerzas elásticas, lo que lleva a la elongación del gel (Fig. 2c). La estructura de los SM, MM y RM no deformados se caracterizó mediante el análisis de sus imágenes SEM y CFM (Sección IV de discusión complementaria y Fig. 9 complementaria). Al determinar el módulo elástico (E), el diámetro (d), la longitud del contorno (R0), la distancia de extremo a extremo (L0 ≈ R0) y el ángulo central (ψ0) de los filamentos en los microgeles de fibrina no deformados (Tablas complementarias 2 –4), encontramos que el módulo de flexión del filamento, \({k}_{{{{{\rm{b}}}}}}}=\frac{9\pi E{d}^{4} {4{\psi }_{0}^{2}{L}_{0}}\) es significativamente menor que su módulo de estiramiento \({k}_{{{{{{\rm{s}} }}}}}=E\frac{\pi {d}^{2}{R}_{0}}{4}\), de modo que kb/ks ≈ 0,1 (Tabla complementaria 4). Por lo tanto, tras el confinamiento biaxial de un gel, los filamentos de fibrina se doblan fácilmente pero resisten el estiramiento. El alargamiento de la red filamentosa sujeta a compresión biaxial se ilustra en la Fig. 17 complementaria.

Desarrollamos un modelo afín teórico (Sección de discusión complementaria V y Figuras complementarias 10-16), en el que se determinó el alargamiento del gel fibroso a partir del equilibrio local de las fuerzas elásticas que actúan en el gel, y se predijo la deformación λz −1 bajo fuerte confinamiento biaxial como

La ecuación (1) muestra que incluso bajo una fuerte compresión (\({\lambda }_{{{\mbox{r}}}}\,\to \,0\)) hay un aumento débil y la subsiguiente saturación del gel tensión de elongación en λz–1 = 0,15 ± 0,05. Tal comportamiento se origina en (i) el pequeño valor de \({\left({k}_{{{{{\rm{b}}}}}}}/{k}_{{{{{{\ rm{s}}}}}}\right)}^{1/2}\) ≈ 0,15−0,4 y (ii) el término entre corchetes se aproxima asintóticamente a \(1{{\mbox{/}}} \sqrt{3}\) para confinamiento biaxial fuerte. Es importante destacar que el prefactor \({\left({k}_{{{\mbox{b}}}}/{k}_{{{\mbox{s}}}}\right)}^{1/2 }\) es independiente de la rigidez del filamento E y está determinada únicamente por la relación de aspecto del filamento d/L0 y el ángulo central de un arco ψ0, que son similares para SM, MM y RM (Tabla complementaria 4).

Para resaltar aún más la diferencia en la tensión inducida por el confinamiento de los geles flexibles y filamentosos, introdujimos una relación de Poisson biaxial \({\nu }_{{{{{\rm{b}}}}}}{{\mbox{ =}}}\,\mahop{{\lim}}\limits_{{\lambda }_{{{{{\rm{r}}}}}}\a 1}\frac{{\lambda }_{ {{{{\rm{z}}}}}}-1}{1-{\lambda }_{{{{{\rm{r}}}}}}},\) que describe la deformación del gel en el dirección sin restricciones en respuesta a deformaciones iguales en dos direcciones radiales, y la extendió a una gran deformación uniforme \({{{{{{\rm{\nu }}}}}}}_{{{{{{\rm{b }}}}}}}^{{{{{{\rm{ef}}}}}}}=-{{{{{\rm{ln}}}}}}{\lambda }_{z} /{{{{{\rm{ln}}}}}}{\lambda }_{{{{{{\rm{r}}}}}}}\). La figura 2d muestra la variación pronosticada de \({{{{{{\rm{\nu }}}}}}}_{{{{{\rm{b}}}}}}}^{{{{ {{\rm{eff}}}}}}}\) para la compresión biaxial uniforme de geles flexibles (como la agarosa) y rígidos (como la fibrina) (Sección de discusión complementaria 5.3.4) y destaca una fuerte diferencia en su respuesta al confinamiento. Para un gel de agarosa, bajo confinamiento fuerte, \({{{{{\rm{\nu }}}}}}}_{{{{{{\rm{b}}}}}}}^{{ {{{{\rm{eff}}}}}}}\) aumenta a un valor asintótico de 2/3, mientras que para el gel de fibrina disminuye a cero, ya que lnλz/lnλr → 0 porque λz se satura al aumentar λr. Tenga en cuenta que en los experimentos, un microgel esférico confinado experimentó una deformación no uniforme, y su parte central experimentó una compresión más fuerte; sin embargo, la extrapolación a 1/λr grande permitió la comparación entre el experimento y la teoría de geles uniformemente deformados.

Se encontró otra diferencia en el comportamiento de los geles filamentosos y de hebras flexibles para su translocación a través de la constricción. La presión de translocación ΔPtr normalizada por la rigidez del gel S aumentó con el aumento de la compresión (Fig. 2e); sin embargo, para 2,0 ≤ 1/λr ≤ 3,5, los microgeles de fibrina pasaron la constricción a valores de ΔPtr/S sustancialmente más pequeños. El confinamiento de microgeles de agarosa condujo a un aumento en la presión osmótica, lo que resultó en la extensión del gel en la dirección longitudinal con el estiramiento de las moléculas de polímero (Fig. 2b, izquierda) y un aumento en la presión de translocación como ΔPtr/S ∼ (1/λr )14/3 17. Por el contrario, la forma de los microgeles de fibrina confinados fue determinada por el equilibrio de la energía de los filamentos comprimidos radialmente y estirados en la dirección longitudinal, lo que resultó en la tensión longitudinal máxima λz ~\(\sqrt{{ k}_{{{{{\rm{b}}}}}}}/{k}_{{{{{{\rm{s}}}}}}}}\). Para 1/λr ≫ 1, el cambio en la presión de translocación escalado como ΔPtr/S ∼\({{\lambda }}_{{{{{\rm{r}}}}}}}^{{-}1 }{{{{{\rm{ln}}}}}}\left({{\lambda }}_{{{{{\rm{r}}}}}}}^{{-}1} \right)\) (Sección de discusión complementaria 5.4), como se muestra en la línea roja continua en la Fig. 2e. Por lo tanto, la dependencia de ΔPtr del confinamiento fue más débil que para el gel de agarosa. Para una compresión de 1/λr > 3,5, un aumento significativo en la fracción de volumen del filamento y las interacciones de los filamentos vecinos restringieron aún más la deformación del gel y dieron como resultado la desviación de los resultados experimentales de la predicción (la línea de puntos roja en la Fig. 2e). Concluimos que para el mismo 1/λr y Δ\({P}_{{{{{{\rm{tr}}}}}}}_{{{{{{\rm{fibrina}}}} }}}}\) < ΔP < Δ\({P}_{{{{{{\rm{tr}}}}}}}_{{{{{\rm{agarosa}}}}} }}}\), el gel de agarosa quedaría atrapado en el microcanal, mientras que un gel de fibrina de la misma rigidez lo pasaría. Para ΔP < Δ\({P}_{{{{{{\rm{tr}}}}}}}_{{{{{{\rm{fibrina}}}}}}}}\), ambos geles obstruirían el canal, sin embargo, el gel de fibrina sería empujado más profundamente y experimentaría una compresión más fuerte, bloqueando así de manera más efectiva el flujo de líquido. Los resultados que se muestran en la Fig. 2 implican que los geles fibrosos actuarían como tapones efectivos para reducir el sangrado o suprimir el suministro de sangre al tumor.

Por otro lado, la fibrina forma el andamiaje de los coágulos de sangre que causan tromboembolismo, una condición patológica en la que un trombo obstruye un vaso sanguíneo en ΔP < ΔPtr, por ejemplo, en algunos tipos de accidentes cerebrovasculares isquémicos (Fig. 3a). Un alargamiento más débil de los microgeles de fibrina inducido por el confinamiento, en comparación con los geles de hebras flexibles, conduce a un mayor aumento en la concentración de fibrina, C/Cfibrinógeno, donde C y Cfibrinógeno son las concentraciones de polímero en el microgel confinado y no deformado, respectivamente. La Figura 3b muestra un aumento de más de siete veces en C/Cfibrinógeno a 1/λr ≈ 4,0 para SM, MM y RM, impulsado por el confinamiento y la pérdida de agua (Figura complementaria 16).

un esquema de la oclusión de una arteria cerebral en el cerebro. b Aumento relativo mediado por confinamiento en la concentración de fibrina en SM obstructivos (círculos rojos sólidos), MM (cuadrados negros sólidos) y RM (triángulos azules sólidos). c Diseño experimental utilizado para estudios de lisis del gel de fibrina confinado. Se infundió una solución de tPA marcado con fluorescencia en TBS a una velocidad de flujo de 5,6 × 107 μm3/sy una diferencia de presión adicional de 0,7 Pa desde un canal colocado ortogonalmente al eje largo del microcanal principal. d Imágenes de microscopía multicanal combinadas de un MM obstructivo (D0 = 200 μm) colocado en Xf = 28 μm a ΔP = 700 Pa y sometido a digestión. Las líneas discontinuas verticales muestran las posiciones originales de los bordes MM posterior y frontal en tlys = 0. Los colores verde y rosa corresponden a FITC-Dextrano (70 kDa) y tPA marcado con AlexaFluor633, respectivamente. e Variación temporal del volumen relativo de RM oclusivo con D0 de 174 μm (triángulos invertidos huecos azules), 199 μm (triángulos azules huecos) y 218 μm (triángulos huecos azules), respectivamente, colocados en Xf = 28 ± 1 μm en el región de microcanal cónico a ΔP de 1200, 1800 y 3000 Pa, respectivamente, y Q = 1860 ± 70 μm3/s. El recuadro muestra RM (D0 = 218 μm) bloqueando el microcanal. f Variación temporal en el volumen relativo de SM, MM o RM (D0 = 197 ± 3 μm) colocado en Xf = 32 ± 12 μm en la zona de microcanal cónico en ΔP de 400, 750 y 1800 Pa y Q de 12300, 2400 y 1860 μm3/s, respectivamente. Xf es la posición del borde frontal del microgel determinada por su distancia desde el comienzo de la constricción. V(tlys) y V0 es el volumen temporal del microgel lisado y el volumen del microgel no perturbado, respectivamente. Los colores de los símbolos corresponden a los de b. Las flechas negras en e, f corresponden al último punto de tiempo antes de que el microgel pasara por el microcanal. Las barras de escala en d, e son 100 μm.

Para examinar las consecuencias del confinamiento en la reducción del flujo de líquido a través de los geles de fibrina obstructivos, estudiamos la lisis de SM, MM y RM infiltrados con un agente trombolítico activador tisular del plasminógeno (tPA). La Figura 3c muestra el diseño experimental utilizado para los experimentos de lisis. A ΔP = 700 Pa (<ΔPtr) y un caudal, Q = 2400 μm3/s, de solución salina tamponada con Tris (TBS) mezclada con 0,1 mg/mL de (isotiocianato de fluoresceína) FITC-Dextran, el microgel ocluyó el microcanal cónico región. La posición del borde frontal, Xf, del microgel determinó su distancia desde el comienzo de la constricción, X0. Para inducir la lisis, se infundió una solución de tPA marcado con fluorescencia en TBS desde un canal colocado ortogonalmente al eje longitudinal del microcanal principal.

Cuando la solución de tPA alcanzó el MM oclusivo, el borde posterior del microgel se volvió borroso, lo que indica el inicio de la digestión de fibrina en el tiempo tlys = 0 (Fig. 3d y Fig. 18 complementaria). Durante la fibrinólisis, el tPA marcado con tinte se acumuló en el interior del MM y se unió a los filamentos de fibrina26, lo que provocó un aumento gradual de la intensidad del color rosa del microgel. En tlys = 60 min, el MM se encogió, debido a la disolución de su parte posterior, mientras que la posición de su borde anterior, Xf, cambió de manera insignificante. Después de 160 min, un MM fuertemente contraído se movió más hacia la constricción, y en tlys = 161 min, pasó a través de la constricción, restaurando así el flujo del líquido a través del microcanal (Fig. 3d y Fig. 18 complementaria, columna derecha) .

La Figura 3e muestra la reducción dependiente del tiempo mediada por lisis en el volumen V (tlys) normalizado por el volumen original, V0, de microgeles de fibrina con diferentes dimensiones. Se colocó un RM con D0 de 174, 199 o 218 μm en el microcanal a ΔP de 1200, 1800 o 3000 Pa, respectivamente, y Q = 1860 ± 70 μm3/s para obstruir el microcanal (Fig. 3e, recuadro) . Con un suministro de tPA, los microgeles se encogieron gradualmente, hasta que se volvieron lo suficientemente pequeños para pasar el canal. Se requirió un tiempo de lisis más largo para la reducción del volumen crítico para RM con un diámetro original más grande. Como el flujo a través de los RM con diferentes dimensiones fue similar, la lisis se produjo a un ritmo similar, lo que resultó en la digestión de una fracción más pequeña de los RM más grandes y su translocación retrasada. La Figura 3f muestra la disminución relativa impulsada por la lisis en V(tlys)/V0 para SM, MM y RM con D0 = 197 ± 3 μm, representada en función de tlys. Cada microgel se colocó en el microcanal a ΔP de 400, 750 o 1800 Pa y Q de 12300, 2400 o 1860 μm3/s para SM, MM y RM, respectivamente. Aunque la presión aplicada a SM fue 4,5 veces menor que la de RM, el flujo a través de SM fue más de seis veces más fuerte, debido a su mayor permeabilidad, y la tasa de contracción del microgel disminuyó de SM a MM a RM. Por ejemplo, en tlys = 78 min, el SM se disolvió y translocó en gran medida, mientras que el MM y el RM, a pesar de mantener solo el 16 y el 20 % de sus volúmenes originales, respectivamente, continuaron obstruyendo el microcanal. Estos resultados indican la importancia de la lisis mediada por convección de geles fibrosos confinados y se correlacionan con informes sobre la digestión más rápida de coágulos con un contenido de fibrina más bajo27,28.

En resumen, nuestro trabajo muestra experimental y teóricamente el mecanismo de respuesta de los geles filamentosos al confinamiento biaxial. El comportamiento de los geles fibrosos bajo confinamiento estuvo regido por la fuerte asimetría en la energía de deformación de los filamentos (suaves a la compresión y rígidos a la extensión) y fue controlado únicamente por la relación de aspecto y la curvatura del filamento. Esta respuesta condujo a un alargamiento mínimo de los geles fibrosos confinados a capilares estrechos, una disminución en su relación de Poisson biaxial con el aumento de la compresión y presiones de translocación más pequeñas, en comparación con los geles de hebras flexibles con una rigidez similar.

Dado que el confinamiento biaxial de partículas blandas deformables se utiliza en una amplia gama de tecnologías29,30,31,32, nuestros hallazgos estimulan el desarrollo de nuevos materiales fibrosos. En particular, el confinamiento biaxial de geles filamentosos en capilares o tubos estrechos daría como resultado su fuerte densificación y una reducción significativa de la permeabilidad. Un flujo de líquido fuertemente suprimido a través de geles fibrosos oclusivos ofrece ventajas en su uso como tapones para prevenir hemorragias o reducir el suministro de sangre a tumores malignos33,34,35. Por otro lado, la reducción del flujo de líquido a través de los geles de fibrina obstructivos y, por lo tanto, la trombólisis mediada por convección suprimida proporciona información sobre la lisis lenta de los coágulos sanguíneos oclusivos27,36,37. Nuestro sistema modelo es el primer paso hacia el desarrollo de la comprensión de las consecuencias de la respuesta mecánica de los hidrogeles de biopolímeros fibrosos al confinamiento biaxial. La incorporación de glóbulos o plaquetas en geles de fibrina obstructiva afectará su comportamiento mediado por confinamiento38 y sería el siguiente paso para descubrir el comportamiento de sistemas biológicamente relevantes más complejos.

Los reactivos para la preparación de microgeles de fibrina y la fabricación de dispositivos MF se describen en la Información complementaria (Métodos complementarios, secciones 2 y 4). Los microgeles de fibrina se prepararon utilizando la emulsificación de la solución mixta de fibrinógeno, tampón Tris y trombina en un dispositivo MF de enfoque de flujo, seguido de gelificación de gotas. Se inyectaron solución de fibrinógeno bovino (60 mg/mL en TBS), tampón Tris y solución de trombina bovina (5 U/mL en solución de CaCl2 10 mM) en el dispositivo MF utilizando dos bombas de jeringa controladas de forma independiente (PhD 200 Harvard Apparatus PHD 2000 Syringe Pump , EE.UU). La fase continua, aceite F que contenía 1% en peso de copolímero de bloque PFPE-P(EO-PO)-PFPE, se inyectó en el dispositivo MF utilizando la tercera bomba de jeringa. Las gotitas generadas en el dispositivo MF se recogieron en un tubo de centrífuga de 15 ml que contenía aceite F. El tubo se colocó durante 1 hora en el baño de agua a 37 °C para completar la gelificación de la fibrina. Se prepararon microgeles de fibrina marcados con FITC a partir de la mezcla de fibrinógeno bovino y fibrinógeno humano marcado con FITC que se mezclaron en una proporción en peso de 33:1, respectivamente. El procedimiento fue idéntico al utilizado para la preparación de microgeles de fibrina.

Los microgeles se transfirieron de F-oil a TBS centrifugando la dispersión a 185 g durante 2 min. Los microgeles sedimentados se dispersaron en aceite F mezclado con 20 % en peso de perfluorooctanol y, después de eso, en hexano que contenía 0,5 % en peso de Span 80, hexano, solución acuosa de Triton X al 0,1 % en peso y TBS. Finalmente, los microgeles se dispersaron en TBS que contenía 0,01 % en peso de Tween 20 y se almacenaron a 4 °C durante aproximadamente 1 a 2 semanas antes de los experimentos.

La fabricación de los dispositivos MF se describe en la Información complementaria (Métodos complementarios Sección 5). En un experimento típico, se utilizó un ΔP positivo controlado por las alturas relativas de los depósitos de agua que se conectan aguas arriba y aguas abajo del dispositivo MF para introducir un microgel con un diámetro de 150 < D0 < 270 μm en un microcanal. El tamaño imperturbable del microgel se determinó imaginándolo en el canal en general. El microgel se detuvo en una zona cónica en la entrada de la constricción. Se usó un programa MATLAB para determinar la posición del microgel a lo largo del eje x cuando la punta frontal del microgel permaneció invariable durante 2 min. Después de un aumento gradual en ΔP, el microgel se movió a lo largo de la zona cónica, hasta que entró en la constricción. Después de la inserción completa del microgel en la constricción, ΔP se redujo rápidamente a cero al equilibrar el nivel del agua entre los depósitos, y el microgel oclusivo se mantuvo en la constricción en un estado estacionario. La longitud del microgel obstructivo se midió después de su confinamiento de 30 min en la constricción.

En el curso de los experimentos de fibrinólisis, las soluciones de dextrano marcadas con t-PA y FITC impregnaron un microgel oclusivo. El flujo de cada líquido se controló mediante imágenes de fluorescencia de canal individual. El t-PA marcado con AlexaFluor 633 se adhirió a las fibras de fibrina y se acumuló en el interior del microgel de fibrina que se encoge (canal TRITC en la Fig. 18 complementaria). La solución de dextrano marcado con FITC se movió a través del microgel sin acumulación.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido. Las imágenes SEM sin procesar del gel de fibrina, las imágenes TEM sin procesar del gel de fibrina antes y después del confinamiento y los datos fuente subyacentes a las Figs. 2 y 3 se proporcionan en el archivo de datos de origen. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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YL reconoce la beca Ontario Trillium. YFL agradece el programa de becas posdoctorales de Banting (NSERC Canadá). EP agradece la Beca para Graduados de NSERC Canadá (Programa de Doctorado). EK y AR agradecen el apoyo financiero de NSERC Canada a este trabajo a través de los programas Discovery y Canada Research Chair. AR reconoce la subvención de ayuda de la Asociación Canadiense del Pulmón. MR agradece el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias (subvención EFMA-1830957) y los Institutos Nacionales de Salud (subvención P01-HL108808).

yang li

Dirección actual: Departamento de Ortopedia, Centro Médico Universitario de Utrecht, Universidad de Utrecht, Heidelberglaan 100, 3584 CX, Utrecht, Países Bajos

Yunfeng Li

Dirección actual: State Key Laboratory of Supramolecular Structure and Materials, Facultad de Química, Universidad de Jilin, 2699 Qianjin Street, Changchun, 130012, China

elisabeth principe

Dirección actual: Departamento de Química, Instituto de Tecnología de Massachusetts, 88 Ames Street, Apartment 306, Cambridge, MA, 02142, EE. UU.

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Instituto Mundial de Primer para el Diseño y Descubrimiento de Reacciones Químicas (WPI-ICReDD), Universidad de Hokkaido, Sapporo, Hokkaido, 001-0021, Japón

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eugenia kumacheva

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YL, YFL y EP realizaron experimentos. YL realizó análisis de datos para el modelado teórico. AR, SP y MR realizaron modelos teóricos. JW discutió e interpretó los resultados experimentales EK supervisó y dirigió la investigación. Todos los autores contribuyeron al manuscrito.

Correspondencia a Arun Ramachandran, Michael Rubinstein o Eugenia Kumacheva.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Jian Ping Gong y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Recibido: 25 enero 2022

Aceptado: 19 de mayo de 2022

Publicado: 07 junio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30980-7

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